Prueba de Western blotting para proteínas de rotavirus

Se realizo la expresión de proteínas estructurales de rotavirus con actividad antigénica utilizando un sistema de transfección bacteriana para las proteínas VP5 y VP8. También se caracterizaron anticuerpos policlonales contra estas proteínas, para el apoyo y desarrollo de otros proyectos de investigación en pruebas de identificación mediante ELISA, "Western blotting", inmunofluoresecencia e inmunocitoquímica en ensayos de inhibición de la infección.

Plásmidos recombinantes y transfección de bacterias
El plásmido pGEX-4T-VP8* contenía la secuencia génica que comprende los nucleótidos 1 a 750 del gen que codifica la proteína rotaviral VP4 de la cepa RRV. Una colonia de bacterias BL21(DE3) fue inoculada en 100 ml de medio LB y cultivada a 37 ºC con agitación constante a 150 rpm durante toda la noche. 

Expresión de las proteínas virales rVP5* y rVP8*
Las alícuotas congeladas de las cepas transformadas fueron sembradas en una caja de Petri en presencia de 100 µg/ml de ampicilina y se incubaron a 37 ºC durante toda la noche.La expresión de las proteínas recombinantes fue evaluada y analizada mediante SDS- PAGE y "Western blotting" frente a un marcador de peso molecular.

Solubilización de las proteínas virales rVP5* y rVP8*
Finalizado el tiempo de expresión, las bacterias fueron centrifugadas a 5000 rpm por 10 min y lavadas dos veces con buffer STE.

Finalmente, las membranas fueron lavadas con PBS. Por otra parte, se analizó el reconocimiento de las proteínas en las partículas virales, para lo cual se emplearon 500 ng de TLPs (partículas de triple capa) de RRV, pero a diferencia del ensayo anterior, se variaron las diluciones de los anticuerpos policlonales, entre 1:250 a 1:1000.

 Referencias
https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/39841/41966