Técnica de Edición Genómica para Gatroenteritis por Rotavirus

Tema: Development of improved vaccine cell lines against rotavirus

Tipo: In vivo posibilidad de cambiar una secuencia de ADN de una forma más fácil, rápida y precisa en puntos concretos del genoma

Dirigido hacia: Gen NEUR en célula Vero

Dirigido por: CRISPR-Cas9
                      CrispR co-transfección de una GFP-Cas9, ARN CRISPR (ARNcr) y el ARN trans-                              activador (ARNtracr)
                      crARN se asocia con Cas9, este complejo localiza y une ADN diana por                                                emparejamiento de bases con ARNtracr
                      Plásmido expresa GFP y gRNA
                      Smartpools

Órganos/sistemas/tejido/célula:  Célula Vero

Vía de administración: Intravenosa

Resultados:  

• Optimización de la transfección en la línea de céluals Vero
• La utilización de ARNsi de control que se dirige directamente al rotavirus para monitorizar los efectos silenciadores sobre la replicación del rotavirus.
• La transfección exitosa da como resultado la muerte celular por apoptosis

REFERENCIAS:

https://www.nature.com/articles/sdata201721

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X18303463

Terapia con Stem Cells en la Gastroenteritis por Rotavirus

Tema: Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host             Restriction, and Pathophysiology.

Tipo de células madre: Tejidos somáticos mesenquimales del intestino delgado

Método de obtención: Muestras de biopsia duodenales e ileales de adultos durante la                                              endoscopia.
                                    Tejido yeyunal se obtuvo de paciente sometido a cirugía bariátrica 
                                     Los HIE se obtuvieron a partir de las muestras de tejido mediante                                           medios completo con factores de crecimiento y medios completos                                         sin factores de crecimiento

Resultados: 

•  Los enteroides son un nuevo modelo in vitro del epitelio del intestino delgado             humano, aumento de células epiteliales diferenciadas, incluyendo enterocitos             absorbentes, células enteroendocrinas y células caliciformes.
•  Los enteroides del intestino delgado humano son más susceptibles a la                       infección por rotavirus humano homólogo que el rotavirus heterólogo animal.
• Los enteroides apoyan la replicación robusta del rotavirus humano G3P ​ y G1pero no una cepa atenuada de vacuna contra el rotavirus humano G1.
• El rotavirus humano infecta preferencialmente enterocitos diferenciados y células enteroendocrinas del epitelio del intestino delgado humano. 
• Los enteroides intestinales humanos se hinchan en respuesta a la infección por HRV y la enterotoxina NSP4

REFERENCIAS:

http://jvi.asm.org/content/90/1/43.full

https://link.springer.com/protocol/10.1007/7651_2017_1

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26446608

ADN Recombinante en la Naturaleza y Artificial Gastroenteritis por rotavirus

DNA Recombinante en la naturaleza 

El DAN se recombina de forma natural mediante procesos como la reproducción sexual, la transformación bacteriana y la infección viral. En el caso del rotavirus, se da al tener contacto con los enterocitos, es decir la infección viral. Dentro de esta nucleocápside se encuentran los once segmentos de ARN de doble cadena (ARNdc) que constituyen el genoma del virus. Estos segmentos cerca de 4,500 pb están organizados con una simetría que parece depender del ensamble icosahédrico de VP2, la cual al hacer contacto con los segmentos de ARN, induce en estos a su recombinación. Las proteínas VP1, VP2 y VP3 están involucradas en la organización del genoma dentro de la nucleocápside mediante interacciones ARN-proteína.

Cuando dos cepas diferentes de rotavirus infectan a la misma bacteria, sus ADNs pueden intercambiar segmentos y, como consecuencia, pueden aparecer partículas virales recombinantes con nuevas combinaciones genéticas.

DNA Recombinante Artificial

La introducción de mutaciones específicas en el genoma de un virus ha permitido en muchos casos el estudio de las funciones de genes individuales, y de secuencias del genoma viral que actúan regulando la replicación, la transcripción y el empaquetamiento viral. La construcción de virus con genomas modificados que llevan inserciones, deleciones o substituciones, también es esencial para el desarrollo de mutantes virales atenuadas. Por otra parte, la posibilidad de introducir secuencias exógenas en un genoma viral permite el desarrollo de vectores virales de expresión o virus recombinantes que presenten epitopes heterólogos.

https://addi.ehu.es/handle/10810/21457

http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1850-00132016000200011

http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752013000100009

Prueba de Western blotting para proteínas de rotavirus

Se realizo la expresión de proteínas estructurales de rotavirus con actividad antigénica utilizando un sistema de transfección bacteriana para las proteínas VP5 y VP8. También se caracterizaron anticuerpos policlonales contra estas proteínas, para el apoyo y desarrollo de otros proyectos de investigación en pruebas de identificación mediante ELISA, "Western blotting", inmunofluoresecencia e inmunocitoquímica en ensayos de inhibición de la infección.

Plásmidos recombinantes y transfección de bacterias
El plásmido pGEX-4T-VP8* contenía la secuencia génica que comprende los nucleótidos 1 a 750 del gen que codifica la proteína rotaviral VP4 de la cepa RRV. Una colonia de bacterias BL21(DE3) fue inoculada en 100 ml de medio LB y cultivada a 37 ºC con agitación constante a 150 rpm durante toda la noche. 

Expresión de las proteínas virales rVP5* y rVP8*
Las alícuotas congeladas de las cepas transformadas fueron sembradas en una caja de Petri en presencia de 100 µg/ml de ampicilina y se incubaron a 37 ºC durante toda la noche.La expresión de las proteínas recombinantes fue evaluada y analizada mediante SDS- PAGE y "Western blotting" frente a un marcador de peso molecular.

Solubilización de las proteínas virales rVP5* y rVP8*
Finalizado el tiempo de expresión, las bacterias fueron centrifugadas a 5000 rpm por 10 min y lavadas dos veces con buffer STE.

Finalmente, las membranas fueron lavadas con PBS. Por otra parte, se analizó el reconocimiento de las proteínas en las partículas virales, para lo cual se emplearon 500 ng de TLPs (partículas de triple capa) de RRV, pero a diferencia del ensayo anterior, se variaron las diluciones de los anticuerpos policlonales, entre 1:250 a 1:1000.

 Referencias
https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/39841/41966

Análisis de PCR para gastroenteritis por Rotavirus/POST

Tema: Conducta terapéutica de los médicos ante el resultado de las pruebas de detección de patógenos en niños con diarrea aguda

Objetivo:  Determinar el impacto de herramientas moleculares para detección de patógenos virales y bacterianos en las decisiones terapéuticas antibióticas en diarrea aguda.

Tipo de Muestra: Heces

Tipo de Ácidos Nucleicos: ADN viral

Extracción de ADN: Disrupción celular (Lisis)

Genes a Codificar: 

VP4          776aa
VP7          326aa

Tipo de PCR: PCR Multiplex

PASOS                                            TIEMPO                                    TEMPERATURA

• Desnaturalización                   30s                                                75º C
• Hibridación                              60s                                                60ºC
• Elongación                              60s                                                72º

Visualización: Electroforesis en gel

Sensibilidad y Especificidad:

                                      Sensibilidad                            Especificidad

Fiebre                             67%                                               46%

Vomitos                           78%                                               41%

Deshidratación               9%                                                 95%

Desnutrición                  18%                                                93%

Referencias:

http://www.medigraphic.com/pdfs/pediat/sp-2018/sp181b.pdf

Pruebas de tamizaje y confirmatoria para Gastroenteritis por Rotavirus

Prueba de tamizaje

SD BIOLINE Rotavirus

Es un inmunoensayo para la detección de rotavirus del grupo A en muestras fecales. La prueba utiliza dos tipos de anticuerpos en inmunocromatografía tipo sándwich de fase sólida para detectar proteínas especificas del grupo, incluyendo la principal proteína de cápside interna presente en los rotavirus del Grupo A.

Alteraciones en el Epigenómica de la Gastroenteritis por Rotavirus

Como conocemos la epigenómica abarca el estudio de los elementos funcionales clave que regulan la expresión génica en una célula.

Alteraciones en la traducción en la Gastroenteritis por rotavirus

Teniendo el resultado de la transcripción, ARNm, es importante entender que cualquier cambio en el ADN repercutirá en el ARNm llevando a la producción de proteínas que no funcionan. 

Alteraciones de la transcripción en la gastroenteritis por rotavirus

Un ARN de cadena doble no funciona como un ARNm y por tanto el paso inicial es la síntesis de ARNm (transcripción).

Alteraciones de la replicación en la gastroenteritis por rotavirus

Los Rotavirus pertenecen a la familia Reoviridae, género rotavirus. La replicación viral se produce tras la adsorción de las células epiteliales columnares que recubren las vellosidades del intestino delgado.

Gastroenteritis por Rotavirus

 GASTROENTERITIS POR ROTAVIRUS

La enfermedad más común en todo el mundo y la causa principal de muerte entre los niños menores de cinco años.

Bienvenidos

Espero que este espacio se convierta en un sitio de aportes científicos acerca de la medicina que nos ayuden a mejorar nuestro aprendizaje en el camino que hemos elegido de convertirnos en médicos.